La espectroscopia de infrarrojo cercano NIRS (por sus siglas en inglés) se emplea para el control de calidad de los alimentos. La determinación de amilosa en el arroz es un carácter heredable que correlaciona con la calidad del grano, importante en los programas de fitomejormaiento de arroz. El presente trabajo, establece la viabilidad de evaluar el contenido de amilosa en el arroz con la técnica NIRS. Inicialmente, se determinó entre arroz paddy o integral, cuál es el más apropiado para evaluar amilosa empleando NIRS. Se tomaron espectros a las 540 materiales de arroz procedentes del germoplasma del Fondo Latinoamericano para Arroz de Riego FLAR, y posteriormente se hizo análisis de componentes principales y análisis de regresión múltiple en cada tipo de arroz. El arroz integral fue el que obtuvo mejores resultados estadísticos. En el desarrollo de la calibración se empleó como referencia otra calibración en NIRS basada en harina de arroz con un R2=0.9 de calibración y R2= 0.78 de validación, y se empleó Winisi para desarrollar la quimiometría. Se utilizó mínimos cuadrados parciales MPLS y una matemática de 2,1,1,2; longitud de onda de1100-2492,2, lo que arrojó un R2≥0.68 de validación externa,aceptable para caracterizar las generaciones tempranas, con aproximadamente el 83% de aciertos. Los programas de fitomejoramiento del FLAR evalúan 15.000 materiales en el año en las generaciones tempranas, lo que significa US$ 3.600 dólares y 45 días menos que evaluar con la calibración de harina de arroz, siendo la que actualmente se emplea en el FLAR.
Palabras clave: Amilosa, arroz integral, calibración, NIRS.
The determination of amilosa in the rice is an inheritable character that it correlates with the quality of the grain, importantly breeder rice. The present work, it establishes the viability of evaluating the content of amilosa in the rice with the technology NIRS. Initially, paddy or integral decided between rice, which is most adapted to evaluate amilosa using NIRS. Spectra took to 540 materials of rice of the germplasms banks of the Latin American Found for Irrigated Rice. FLAR, and later there was done analysis of principal components and analysis of multiple regression in every type of rice. The brown rice was the one that most better statistical results. In the development of the calibration another calibration used as reference in NIRS based on flour of rice with a R2 = 0.9 of calibration and R2 = 0.78 of validation, and Winisi was used to develop the chemometrie. There was in use square minimums partial MPLS and a mathematics of 2,1,1,2; wavelength de1100-2492,2, which a R2 = 0.68 of external, acceptable validation to characterize the early generations, with approximately 83 % of successes. The programs breeding of the FLAR evaluate 15.000 materials in the year in the early generations, which means US$ 3.600 dollars and 45 days less that to evaluate with the calibration of flour of rice, being the one that nowadays is used in the FLAR.
Key words: Amylose, brown rice, calibrations, NIRS
Fondo Latinoamericano para Arroz de Riego (FLAR). Colombia-Palmira.
Universidad Santiago de Cali y Universidad del Valle, Colombia-Cali
El arroz, el trigo y el maíz son los tres cereales de mayor importancia en el mundo, suscitando una alta influencia en la nutrición humana y en la seguridad alimentaria (1). Un aspecto importante en el arroz son las características culinarias las cuales están relacionadas con la estructura química delalmidón (2), este polímero está compuesto por dos moléculas,una es la amilosa y la segunda la amilopectina (3), el mayor o menor contenido de amilosa en el grano determina la calidad en cuanto a su cohesividad, textura y brillo del arroz cocido (4).En general, se puede considerar que el contenido de amilosa relaciona varias características de la calidad culinaria del arroz.
Existen variasmetodologíasutilizadas para la determinación del contenido de amilosa, una es el métodocolorimétrico registrado por la Asociación Americana de Química de Cereales AACC (5),el cual ha sido consideradode referencia para determinar el contenido de amilosa en programas de mejoramiento de arroz (6). El NIRS,es un instrumento usado en la determinación del almidón de arroz (6 y 7). Para evaluar el contenido de amilosa empleando el NIRS, se requiere realizar una calibración utilizando la quimiometría como herramienta principal,que permite obtener un modelo matemático ideal para predecir el contenido de amilosa en el arroz. En la literatura se reportan diferentes calibracionesparadeterminar el contenido de amilosa de forma rápida y con poca cantidad de muestra, favoreciendo el proceso de selección genética en los programas de mejoramiento de arroz (3, 8 y 9).Asimismo, se reportan trabajos de caracterización de amilosa utilizando calibraciones obtenidas en el NIRS con muestras de arroz integral (10 y 11).
La técnica NIRS para evaluar el contenido de amilosa, es la principal metodología empleada en el Fondo Latinoamericano para Arroz de Riego FLAR y en el Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT, esta metodología es utilizada con muestra de harina de arroz. La preparación de la harina, consiste en secar,descascarar, pulir y pulverizar el arroz, y luego dejar en reposo durante ocho horas para estabilizar la humedad de la harina, esteproceso es consideradolargo y dispendioso,afectando la eficiencia en laevaluación de amilosa. Se estimó una reducción significativa al calcular el tiempo y costo para realizar el mismo análisis empleado arroz con menos proceso de preparación de muestra: como arroz paddy o arroz integral, dejando como resultado optimización del proceso. En el mismo orden de ideas, evaluar el contenido deamilosa en muestra con la menor manipulación y preparacióncontribuye con los resultados del programa de fitomejoramiento del FLAR y el CIAT,no sólo porque se reduce el tiempo de preparación de muestrasy el costo de operación, sino también porque se entregan más rápido los resultados y se genera mayor capacidad de análisis, teniendo en cuenta que,en los últimos años se ha venido incremento el número de evaluaciones de amilosa en el laboratorio de calidad de arroz del FLAR, pasando de evaluar 13000 muestras en el año2008 a 20000 muestras en el año 2014.
El objetivo de este trabajo es establecer la viabilidad de realizar una calibración en el NIRS que cuantifique amilosa con arroz en paddy o arroz integral ya que estos dos requieren menos proceso de preparación de muestra, contribuyendo en la optimización del análisis y en la efectividad en la entrega de resultados a los mejoradores de arroz, quienes utilizan los datos para continuar sus avances de mejoramiento genético.
Las actividades de este estudio se desarrollaron en el Laboratorio de Calidad de Arroz del Fondo Latinoamericano para Arroz de Riego -FLAR, ubicado en el Centro Internacional de Agricultura Tropical – CIAT. Este Centro de Investigación está localizado en el kilómetro 17 recta Cali – Palmira, municipio de Palmira, Valle del Cauca. Con una temperatura promedio de 26ºC, una altura de 1001 m.s.n.m. y con coordenadas 3° 29’56.42” Latitud Norte, 76° 21’22.36” Longitud Oeste . La temperatura promedio del Laboratorio de Calidad es 22 ºC y humedad relativa de 56%.
La muestra utilizada fue arroz paddy y arroz integral, para el método de referencia se utilizó harina de arroz pulido. Se tomaron540 accesionesprocedentes del banco de trabajo del CIAT con las cuales se realizó un barrido espectral que permitió determinar el estado del arroz ideal para desarrollar la calibración. Se realizó la calibración del equipo con los495 materiales más representativos de la muestra inicial, donde se utilizaron variedades de arroz del CIAT, líneas y variedades del FLAR, y un panel de diversidad de sub especies indicas de arroz obtenidas del banco de semilla del Instituto Internacional de Investigación de Arroz IRRI (por sus siglas en ingles). Para la selección de la muestra se tuvo en cuenta el contenido de amilosa por categoría: alta, intermedia y baja como también diversidad en la información genética.
La muestra utilizada en arroz paddy se secó al sol y luego se limpió las impurezas como piedras, raquis, raquillas arroz vano y otros. La muestra en arroz integral además de la limpieza se descascaró en un molino Suzuki MT-2005 N° 4.259-6; estos procesos se hicieron tanto para el barrido espectral como para el desarrollo de la calibración. Para el método de referencia se utilizó muestra en harina, la preparación de la harina de arroz también demandódelimpieza, secado, descascarado pulió del grano utilizando el molino Suzuki MT-2005 N° 4.259-6, que además de tener la opción de descascarar permite pulir el arroz. Posteriormente, las muestras fueron pulverizadas en un molinoCycloneLabSampleMill 3010-080p, con un tamaño de partícula 5mm.
Las muestras de arroz: paddy, integral y harina se analizaron y escanearon por duplicado empleando NIRSSystem 6500 con reflectancia (1/log R) y un rango de longitud de onda de 400-2,498 nm.Se tuvo en cuenta el mismo orden de escaneo desde el paddy hasta harina de arroz.
En la seleccióndel estado del arroz indicado para desarrollo de la calibración, se realizó análisis espectral utilizando herramientas estadísticas como: análisis de componentes principales ACP y la distancia de Mahalanobis (12).También, se realizó regresiones múltiples, y finalmente,se discrimino por tendencias teniendo en cuenta el comportamiento delos espectros con respecto a la clasificación por categoría de amilosa.
Seempleo el softwareWinisi paraestablecer los ajustes decalibración:limpieza de ruidos, segmentación de espectro por longitudes de onda,aplicación de la segunda derivada utilizada en granos enteros (13), gap, smooth, logaritmos y regresión. Se hizo una matriz de resultados con los datos obtenidos teniendo en cuenta las diferentes variables mencionadas, de esta forma se proyectó el mejor coeficiente de determinación R2 , el error estándar de calibración SEC y el error estándar de validación cruzada SECV. Lo anterior se realizó utilizando la herramienta Monitor Result del programa-Winisi que trae consigo el NIRS. Por otro lados se calculó la desviación residual predictiva RPD ≥ 3.0, considerando que para este rango se puedepredecir datos y categorizar por alto, intermedio y bajo la amilosa (6).
Se tomaron232 muestrasconocidas entre alta, intermedia y baja, estas muestras fueron también utilizadas en la calibración. Se calculó R2, SEP y Slope utilizando Monitor Result.
En la validación externa se empleó 47 muestras desconocidas por la calibración, se calculó R2 y SEPcon el Monitor Result, y se hizo un ANOVA para determinar si se presentan diferencias significativas entre los valores de referencia y los predichos por la nueva calibración. Se halló el porcentaje de aciertos; donde aciertos=% aciertos/total. Lo anterior,dadoque los fitomejoradores de arroz;buscan categorizar los materiales entre alto, intermedio y bajo en amilosa, y seleccionarlos entre los descartables y los promisorios, sin importar la exactitud del valor.
Se realizó cálculos y tablas comparativas que permitieron estimar el tiempo y costo de la nueva calibración con respecto a la ecuación en harina de arroz.
Se encontraron APC mayores a 10,aceptables para realizar calibraciones en arroz paddy y arroz integral (13). Para el coeficiente de determinación el más representativo fue el R2 dela regresión múltiple de arroz integral (R2=0.47), se midió la distancia de Mahalanobis al centro poblacional (12) para lo cual se observaron 60 materiales atípicos en arroz paddy y 45 muestras atípicas para arroz integral.
Dado los resultados del coeficiente de regresión fue considerado poco factible obtener una calibración con arroz paddy, por lo anterior, se consideró realizar solo unacalibración empleando arroz integral. Las muestras atípicas identificadas por el cálculo de la distancia de Mahalanobisfueron eliminadas, considerando que los espectros restantes traen información limpia y representativa. En el Cuadro 1, se presenta las combinaciones más distintivasen las variables de calibración con la que se obtuvo 2inte.eqa;empleando 435 datos, con una matemática de 2,1,1,2 y una segmentación de longitud de onda de 11000-2492,2, un suavizado con la opción SNV and Detrend y un modelo de regresión de mínimos cuadrados parciales MPLS. Los resultados estadísticos obtenidos fueronSEC 0,33 SECV 1,20 R2 0,99 y RPD 3,06.
Se encontró un R2 = 0,83 (Figura 1) y SEP 1,23 y Slope 0.4, indicando una alta significancia en la predicción de datos.
La validación interna fue mejor que la validación externa ya que en esta se obtuvo R2=0,68 (Figura 2) y SEP= 1,4. Los datos del ANOVA con un ∂ 0,05 (Tabla 1) no presento diferencias significativas con un p=0,34; lo que indica, que entre los datos obtenidos por la calibración con harina de arroz y los datos predichos por calibración con arroz integral se presentan similitud.
Con los 47 materiales se hizo una comparación entre el valor de referencia y los valores arrojados con la nueva calibración, y se estimóel porcentaje de aciertos, considerando en esta comparación los aciertos por rangos de amilosa: alto (28-33 %), intermedio (23-27.9 %) y bajo (< 22.9%). Para este ensayo se obtuvo el 83% de aciertos, lo que define que para 20000 muestras año se obtendrían 17021 aciertos.
En la Tabla 2 se observa que utilizar muestras en arroz integral reduce el costo en US $23dólares.
En los programas de mejoramiento del FLAR y el CIAT se analiza el contenido de amilosa desde generaciones tempranas F3 hasta generaciones avanzadas F6, de acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 2, y al 83% de aciertos obtenidos, se realizó un cálculo de costo y tiempo evaluando el contenido de amilosa en generaciones tempranas empleando la calibración de arroz integral, y las generaciones avanzadas empleando la calibración en harían de arroz que es más robusta y precisa, lo anterior, como una estrategia de mejoramiento y selección de material promisorio manteniendo el criterio en lo posible de optimización del proceso.
En la Tabla 3, se observa el tiempo y costo de evaluación del contenido de amilosa en el año, evaluandoen generaciones tempranas, 15000 muestras aproximadamente con la calibración 2inte.eqa y 5000 muestras de líneas avanzadas empleando la calibración de harina de arroz.
De acuerdo a los resultados, se consideró realizar la calibración con arroz integral, donde se encontró un buen ajuste en las respuestas de los datos, con un mínimo de 23 componentes principales (>10 ACP) y adicionalmente se tuvo en cuenta el criterio de la distancia de Mahalanobis al centro poblacional (12) para lo cual se observaron 45 muestras atípicas las cuales fueron eliminadas, considerando que los espectros restantes traen información limpia y representativa.También se determinó el coeficiente de determinación dela regresión múltiple de R2=0.47 valorado comopoco representativo, pero siendo más alto al compararlo con el R2 obtenido para arroz paddy R2=0.10.Se probaron 32 combinaciones matemáticas de las cuales se encontraron 11 combinaciones con R2>0,90. Sin embargo, al realizar el análisis de desviación residual predictiva (RPD) se observaron solo tres combinaciones con valores cercanos a 3,0 (cuadro 1). Es de considerar que a mayor RPD mejor precisión, y que valores cercanos a 3,0 permiten establecer valores de referencias y permite categorizar por rango las muestras evaluadas (6).Con respecto al análisis de aciertos y a la predicción de los datos se puede considerar que es posible utilizar el modelo matemático encontrado con arroz integral 2inte.eqa para evaluar 15000 líneas de arroz en el año desde F3 hasta F6, con el 83 % de aciertos, considerando que es un porcentaje representativo para la selección temprana de poblaciones segregantes (9 y 10), las 5000 muestras evaluadasen generaciones avanzadas en el año requieren más detalle y precisión, para lo cual se pueden evaluar con la ecuación matemática hecha para harina de arroz, la cual tiene un R2 0.78 de validación externa. Simplificando el proceso de preparación de la muestras en la evaluación de amilosa en generaciones tempranasse puede optimizar el proceso en menor tiempo y costo, lo que significa reducción en 48 días laborales y US $3,500 dólares menos que al analizar el 100% de las muestras con harina de arroz, generando un valor agregado a los fitomejoradores del FLAR y el CIAT.
En los programas de mejoramiento de arroz es posible utilizar calibraciones en NIRS que permitan la predicción de datos en generaciones tempranas de acuerdo a los valores estadísticos en arroz integral, permitiendo contribuir de forma no destructiva, rápida y rentable en el desarrollo del cultivo de arroz para la calidad del grano.
Ing. Andres Zuluaga Suarez, por la contribución durante su práctica profesional. A la Dra.Miryam Cristina Duque y Juan Cuasquer por la contribución y aportes en estadística. Al FLAR y al CIAT por el apoyo para el desarrollo de los trabajos en el Laboratorio de Calidad de Arroz.
Recibido: 17-05-2016
Aceptado: 18-11-2016